顯微鏡的優點、用途以及七種觀察方式

2010-08-24

（一）、顯微鏡的優點：

1、檢出能力高（放大作用）
2、對細胞的刺激小（可以活體染色）
3、能進行多重染色
（二）、顯微鏡的用途：1、 物體構造的觀察——熒光素
2、 熒光的有無、色調比較進行物質判別——抗體熒光等
3、 發熒光量的測定對物質定性、定量分析
熒光原理圖

（三）、顯微鏡的七種觀察方式一、相差鏡檢法（Phase contrast PH）
在光學的發展過程中，相差鏡檢術的發明成功，是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道，人眼只能區分光波的波長（顏色）和振幅（亮度），對于無色通明的生物標本，當光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標本.
相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現象，將人眼不可分辨的相位差變為可分辨的振幅差，即使是無色透明的物質也可成為清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察，因此相差鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡。
相差圖片

相差的基本原理是，把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變為1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處：
1. 環形光闌（annular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。
2. 相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：
1. A 相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加變亮，形成亮反差（或稱負反差）。
2. B 相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結構比周圍介質更加變暗
相差原理
二、微分干涉稱鏡檢術（Differential interference contrast DIC）
微分干涉鏡檢術出現于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優點，觀察效果更為逼真。
原理；
微分干涉稱鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等，光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現重影現象，使圖象呈現出立體的三維感覺。
微分干涉圖片
DIC的物理原理完全不同于相差顯微鏡，技術設計要復雜得多。DIC利用的是偏振光，有四個特殊的光學組件：偏振器（polarizer）、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器（analyzer）。偏振器直接裝在聚光系統的前面，使光線發生線性偏振。在聚光器中則安裝了偌瑪斯斯棱鏡，即DIC棱鏡，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二者成一小夾角。聚光器將兩束光調整成與顯微鏡光軸平行的方向。初始兩束光相位一致，在穿過標本相鄰的區域后，由于標本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個偌瑪斯斯棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波合并成一束。
這時兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。后光束穿過第二個偏振裝置，即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時，沒有光穿過檢偏器；光程差值等于波長一半時，穿過的光達到大值。于是在灰色的背景上，標本結構呈現出亮暗差。為了使影像的反差達到更佳狀態，可通過調節DIC滑行器的縱行微調來改變光程差，光程差可改變影像的亮度。調節DIC滑行器可使標本的細微結構呈現出正或負的投影形象，通常是一側亮，而另一側暗，這便造成了標本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕
微分干涉原理圖
三、偏光（Polarizing microscope POL ）
偏光顯微鏡的特點
偏光顯微鏡是鑒定物質細微結構光學性質的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當然這些物質也可用染色發來進行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。
偏光顯微鏡的特點，就是將普通改變為偏光進行鏡檢的方法，以鑒別某一物質是單折射（各向同行）或雙折射性（各向異性）。
雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物，化學等領域。在生物學和植物學也有應用。
四、浮雕相襯顯微鏡（RC HMC ）
1975年，Robert Hoffman 博士發明
2002年，專利到期，各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術產品
原理
斜射光照射到標本產生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調節器產生不同陰影，從而使透明標本表面產生明暗差異，增加觀察對比度
特點
提高未染色標本的可見性和對比度；
圖象顯示陰影或近似三維結構而不會產生光暈；
可檢測雙折射物質（巖石切片、水晶、骨頭） ；
可檢測玻璃,塑料等培養皿中的細胞,器官和組織；
聚光鏡的工作距離可以設計的更長；
RC物鏡也可用于明場,暗場和熒光觀察
五、熒光（Fluorescence Microscopy FL）
熒光鏡檢術是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發后而產生長波長的熒光，然后觀察。
熒光圖象

六．明視野觀察（Bright field BF）
明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式，廣泛應用于病理、檢驗，用于觀察被染色的切片，所有顯微鏡均能完成此功能。
明視野
七．暗視野觀察（Dark field DF）
暗視野實際是暗場照明發。它的特點和明視野不同，不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此，視場成為黑暗的背景，而被檢物體則呈現明亮的象。
暗視野的原理是根據光學上的丁道爾現象，微塵在強光直射通過的情況下，人眼不能觀察，這是因為強光繞射造成的。若把光線斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了體積，為人眼可見。
m..m 暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體，而是將光線改變途徑，使其斜射向被檢物體，使照明光線不直接進入物鏡，利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象。暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察，更高達0.02—0.004
暗視野