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高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）的基本流程

2010-12-22

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）的基本流程
在“色譜原理”的相關章中已略述了HPLC與經典的液相色譜之間的差異。經典的液相色譜采用的固定相粒度范圍大，形狀不規則，分離的組分在術中擴散厲害。同時，分離的組分在固定相中受到阻力大，滯留時間長，譜帶加寬，分離效果差，而且每根色譜柱僅能分離一次樣品，消耗大。另外，經典的液相色譜借助于流動的重力或其它的簡單裝置讓流動相自上而下地流過色譜柱，又未能采用高靈敏度的檢測器，存在分析速度慢、靈敏度低的缺點。
用經典的液相色譜分析氨基酸，近2m長，1cm粗的玻璃柱，固定相為離子交換樹脂，用去流動相近1000mL,花費20h分離了20種氨基酸。繼而英國科學家馬廷用一根30cm長的玻璃柱，液-液分配色譜方法分離子氨基酸。為此他獲得了1952年諾貝爾化學獎。
有HPLC分離氨基酸，20cm長，4.6mm內徑的不銹鋼柱，內填0.7um的HPLC用的固定相，僅30min，用去流動相15mL分離出近20種氨基酸。
神奇的HPLC神奇在哪里？
這種神奇在于固定相，也稱HPLC填料。HPLC采用5 ~ 10um小顆粒的球形填料，常用的是球形硅膠，無論是鍵合的，還是未鍵合的，都有一定的孔徑和較大的比表面積，粒度很均勻。
一根25cm長，內徑為4.6mm的HPLC柱可達數萬個理論塔片，比經黃的液相色譜柱高出3—4個數量級的柱效，可分離上百個組分。因分辨率高，在一長色譜圖上可容納很多的色譜峰。
HPLC填料除了顆粒細、阻力小、傳力快、分離效果好外，還有各種不同性能的填料，為分離各種性能不同的組分提供了條件。
HPLC的色譜柱是封閉式、小尺寸，在同一根色譜柱可反復進樣品數百次分析測定，配上性能優良的高壓輸液泵，使流動相快而穩定地通過色譜柱，分析速度快，結果更準確。
HPLC的高壓部分處于全封閉狀態，從進樣到檢測組裝在一個系統中，減少了對環境的污染，易于實現自動化和半自動化操作，更省力省時。
由于以上種種優點，HPLC更適合于高沸點、大分子、極性強和熱穩定性差的組分的分離和分析，所以HPLC獲得廣泛的用途。
1、HPLC裝流動相的儲液器
HPLC的儲液器用200—1000mL的優質玻璃瓶或者石英瓶。注意保持儲液器的清潔，除了定期清洗外，每次更換新的流動相前都要清洗掉原使用的流動相殘留。新配好的流動相要在特制的抽濾瓶中抽濾掉可能損壞泵和污染色譜柱的雜質顆粒，可部分抽去溶解于流動相中的空氣。
脫氣很重要，因為溶解于流動相中的空氣會影響色譜系統的性能：在泵中聚積氣泡使壓力不穩致流速不穩，氣泡進入檢測器會吸附在檢測器池壁上，增加檢測器噪聲，降低靈敏度甚至信號消失。流動相中有O2對光電檢測器的影響大，使紫外檢測器的基流增大，在低波長檢測時信號被子低消掉。在熒光檢測器中O2會熄滅組分的熒光，降低靈敏度。在還原型的電化學檢測器中存在O2會阻撓反應的進行。
用水配制的流動相極易溶解進空氣能達到飽和狀態，而無水的流動相（正相色譜）不存在這個問題。
抽濾法脫氣只是暫時性的，使用過程中空氣又溶入流動相，有效的方法為在線氦脫氣。氦不溶于流動相，將氦緩緩地通往流動相能趕出溶入的空氣，通氦10min可除去80% ~ 90%溶入的氣體，效果極佳。繼續地通入小流量的氦氣可防止空氣再溶入和反擴散。
有一個典型的例子，可以看到空氣對紫外檢測器和熒光檢測器的影響，以可以看到氦脫氣后的效果。用反相色譜方法，固定相為C8鍵合相填料，流動相為水-乙腈，測定組分為萘。開始氦脫氣，萘在紫外檢測器和熒光檢測器的出峰信號正常。停止氦脫氣，紫外檢測器的基線抬高，熒光檢測器的信號變小。再開始氦脫氣，兩個檢測器的信號慢慢恢復正常。
2、 HPLC的輸液泵
曾經有多種類型的HPLC輸液泵。這里僅介紹目前常用的往復式恒流柱塞泵。
這種泵主要由人造寶石的柱塞桿、人造寶石單向閥和密封墊圈等組成，接在發動機上的凸輪驅動有彈簧裝置的柱塞桿來回運動。
進口單向閥安裝在泵的底部，出口單向閥同向安裝在泵的上部，這樣有利于氣泡的排出。安裝在流動相進口端，寶石座與落下的寶石球成切線密封，寶石球彈起時又為篩網所擋。密封墊圈是用聚合物加耐磨物質制成的。密封墊圈質軟，外側緊緊地嵌在泵體中，內側緊緊地包裹住光滑的人造寶石桿。因柱塞桿不斷運動，密封墊圈需要經常更換，屬正常消耗品。
吸進流動相當凸輪漸漸脫離柱塞桿，因彈簧作用，柱塞桿由泵腔向外運動，泵腔壓力較低，進口單向閥的寶石球彈起來，而相同方向的出呂單向閥的寶石球在大氣壓力的作用下緊緊與閥座相切而密封。流動相不斷流入泵腔中。
排出流動相凸輪轉動一周后又漸漸擠緊柱塞桿，迫使用權柱塞桿向泵腔內運動，進口單向閥關閉，出口單向閥打開，流動相被打入色譜柱內。
若是用一個單柱塞泵吸液和排液脈沖很大。為了減小脈沖可用雙泵式柱塞泵，一個泵吸液，另一個泵排液，兩泵相關180°，加上流速調節器和壓力傳感器，可使壓力變化更和諧，運動曲線近似一條直線。
流動相經高壓泵輸液后進入進樣器，再到色譜柱和檢測器，這部分均呈密封高壓狀態，所有部件要能承受5—15MPa或更高的壓力，其管道和接頭都是耐壓的不銹鋼材料。
3、HPLC的進樣器
GC可以采用柱頭進樣器進樣，因為GC的壓力小，只要有一定的進樣技巧就可以獲得良好的分析結果。而在HPLC中采用柱頭方式進樣，因在高壓狀態下困難很大，難以獲得精確的結果。
六能平面進樣閥是HPLC理想的進樣器，在HPLC系統中的位置所示。
六能平面進樣閥的主要部件是閥的后蓋不銹定子和用高聚物復合材料制成的轉子。轉子耐磨而密封性能好，緊緊壓在定子上。定子有六個均勻的小孔，孔與孔之間的夾角為60°，可以先看一看定子通道的連接法：孔1進樣，孔2排出多余樣品，；孔3、孔6連接定量的樣品管；孔4接泵；孔5到色譜柱。
六能平面進樣閥有兩種方式：外裝式進樣和內裝式進樣，定子一樣，區別在轉子的導槽上。內裝式進樣死體積小，樣品用量少，多采內裝式六能平面進樣閥。但有時需要在線分析或自動化分析還是要用外裝式六通平面進樣閥。
4、HPLC的色譜柱
術是HPLC系統的心臟部件，許多分離問題都歸于柱。根據要分離的理化性質決定用什么樣的色譜柱，也就確定了采用何種色譜方法。